蜂蜜中的酶及其在蜂蜜质量控制中的应用 ！

0引言

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露,与自身分泌物结合后,经充分酿造而成的天然甜物质,具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌、促进伤口愈合等多种生物学活性。蜂蜜的化学成分复杂,主要由糖类、水分、蛋白质、酶类、氨基酸、维生素、矿物质、酸类、酚类等物质组成。

蜂蜜中含有淀粉酶、蔗糖转化酶、葡萄糖氧化酶和β-葡萄糖苷酶等多种生物酶,这是其不同于其他甜味剂的特征之一。蜂蜜中的酶活指标是蜂蜜质量控制的重要参数,在蜂蜜品质(新鲜度、成熟度、糖浆掺假和热加工等)监测中具有重要作用,发酵、浓缩加工和长时间贮存等都会使蜂蜜的相关酶活指标降低。本文对蜂蜜中的主要酶类进行介绍,并对其在蜂蜜品质检测方面的研究进展进行综述,为我国蜂蜜的质量控制和品质评价提供借鉴和帮助。

1蜂蜜中酶的种类及来源

蜂蜜中的酶类有淀粉酶、蔗糖转化酶、葡萄糖氧化酶、β-葡萄糖苷酶、过氧化氢酶、磷酸酯酶,还有少量的蛋白酶、还原酶等。它们大多来源于蜜蜂,也有少量来源于花蜜和花粉,还有一些可能来源于能分泌蜜露的昆虫。蜂蜜中各种酶的含量受加工参数、贮存条件及时间、蜜粉源植物丰度、蜂蜜成熟度、蜂群的状态和群势、蜜蜂咽下腺的季节性活动及蜜蜂的种类、营养情况、日龄等因素影响。蜂蜜中主要的酶类见表1。

淀粉酶是一组天然存在于蜂蜜中的酶,包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶随机切断淀粉糖链内部的α-1,4-糖苷键,产生各种糊精,β-淀粉酶从非还原性末端逐次以麦芽糖为单位切断α-1,4-糖苷键。蜂蜜中的淀粉酶主要由工蜂的咽下腺分泌,此外还可能来源于蜜源植物的花蜜或花粉。

研究者认为蜜蜂向蜂蜜中分泌淀粉酶是其生理需要,能提高二糖类物质的利用率,增加能量的供给。测定蜂蜜中淀粉酶活性有哥德法和分光光度法,国际上通用分光光度法测定蜂蜜的淀粉酶活性,结果用淀粉酶值(DN)来表示。我国现行国家行业标准(GH/T18796—2012《中华人民共和国供销合作行业标准蜂蜜》)规定,荔枝蜂蜜、龙眼蜂蜜、柑橘蜂蜜和鹅掌柴蜂蜜淀粉酶值不小于2,其他蜂蜜则不小于4。

蜂蜜中的蔗糖转化酶(α-葡萄糖苷酶)是蜜蜂在酿造蜂蜜的过程中添加进去的,由蜜蜂的咽下腺分泌。蔗糖转化酶催化花蜜中的蔗糖生成葡萄糖和果糖,是花蜜转化为蜂蜜的关键酶。测定蔗糖转化酶活性的方法常用西根哈勒法(siegenthalermethod)或哈多恩法(hadorn method),结果可表示为转化酶值(IN)或每千克转化酶(US)。对于新鲜和未加热的蜂蜜,BOGDANOV等建议转化酶值高于10 IN(73.5 US),对于低转化酶活性的蜂蜜,建议转化酶值高于4 IN (29.38 US)。

蜂蜜中的葡萄糖氧化酶是由蜜蜂的咽下腺分泌的,在有氧条件下葡萄糖氧化酶能专一性地催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢,葡萄糖酸则是蜂蜜中的主要酸性物质,增加蜂蜜的酸度,而过氧化氢是绝大多数蜂蜜发挥抑菌活性的主要物质基础之一。在未成熟或稀释的蜂蜜中葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化反应的速度较快,一旦蜂蜜中水分降到19%以下,催化作用便基本停止。常用于检测葡萄糖氧化酶活性的方法有滴定法、分光光度法和比色法等。

1986年,LOW等初次在蜂蜜中检测到β-葡萄糖苷酶,之后的研究表明蜂蜜中的β-葡萄糖苷酶是由工蜂咽下腺分泌的。β-葡萄糖苷酶可水解结合于末端、非还原性的β-D-葡萄糖苷,同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。常见测定β-葡萄糖苷酶活性的方法有分光光度法、荧光法和比色法等。

DUSTMAN研究表明蜂蜜中的过氧化氢酶源于植物,主要源于花粉,极少量源于花蜜,可将葡萄糖氧化酶催化β-D-葡萄糖产生的过氧化氢转化为水和氧气。HUIDOBRO等提出了一种可精确测定蜂蜜中过氧化氢酶活性的改进型方法,通过测定蜂蜜中过氧化氢酶活性,可预测蜂蜜的抑菌能力。

磷酸酯酶可水解磷酸酯类物质,酸性磷酸酶是蜂蜜中的主要磷酸酯酶。1938年,GIRI首次在蜂蜜中检测到酸性磷酸酶,该酶主要来源于花粉,少量来源于花蜜。酸性磷酸酶可将有机磷酸盐转化为无机磷酸盐,是蜂蜜发酵的一个潜在评价指标。常以β-甘油磷酸盐或磷酸苯基二钠为底物来测定酸性磷酸酶活性。

表1 蜂蜜中主要酶类的简介 

2酶在蜂蜜贮存过程中的活性变化

蜂蜜的新鲜度(贮存条件)通常通过某些随温度或时间增加或减少的指标的参数值来评估。最常用的参数则是淀粉酶、羟甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural,HMF)和蔗糖转化酶。许多国内外蜂蜜标准都将淀粉酶和HMF列为蜂蜜质量控制的重要指标(表2)。

2.1淀粉酶在蜂蜜贮存过程中的活性变化

近年来研究发现淀粉酶活性在蜂蜜贮存过程中会发生规律性变化。李军生等研究了贮存温度和时间对天然蜂蜜(天竺桂蜜和野桂花蜜)中淀粉酶值的影响,结果发现在低温条件下(10℃),蜂蜜的淀粉酶值不受贮存时间的影响,基本保持稳定,但随着贮存温度的提高(37、45℃)以及贮存时间的延长(0、10、20、30 d),淀粉酶值则呈现下降的趋势。鲍会梅研究了不同贮存条件下洋槐蜜的淀粉酶值,发现天然洋槐蜜的淀粉酶值明显受贮存时间和温度的影响,在45℃贮存30 d后,洋槐蜜淀粉酶值由最初的11.54降低为4.09。

类似的研究表明,龙眼蜜在52℃贮存21天后,其淀粉酶值由10.93降低到5.39。祝美云等研究了不同等级蜂蜜中淀粉酶活性变化,发现随着贮藏时间的延长,各等级蜂蜜的淀粉酶值均出现下降,优质蜂蜜的淀粉酶值受贮藏时间影响较大,而劣质蜂蜜的淀粉酶值则变化较小。

这可能是由于优质蜂蜜的基础淀粉酶值高于劣质的蜂蜜,所以当贮存时间延长,优质蜂蜜的淀粉酶值下降程度高于劣质的蜂蜜。国占宝等测定了荆条蜜、枣花蜜和洋槐蜜在光照和遮光条件下分别贮存30、60和90天的淀粉酶活性,发现3种蜂蜜的淀粉酶值在光照和遮光条件下均随着贮存时间的延长而下降,遮光有助于蜂蜜保持较高的淀粉酶活性,但差异不显著。

SERAGLIO等研究了巴西甘露蜜在室温下(23.0±2.30)℃贮存24个月的淀粉酶活性变化,发现随着贮存时间的延长,淀粉酶活性呈现下降趋势,与新鲜甘露蜜相比,贮存24个月的蜂蜜其淀粉酶活性显著降低。

综合上述分析发现,蜂蜜中淀粉酶活性会随着贮存温度的升高和贮存时间的延长呈现下降趋势。出于对蜂蜜中酶活性的考虑,蜂蜜适合贮存在低温条件下。

2.2蔗糖转化酶在蜂蜜贮存过程中的活性变化

许多研究表明蔗糖转化酶对温度更敏感,比淀粉酶更适合作为蜂蜜新鲜度的指标。目前,包括德国、意大利以及瑞典在内的一些欧洲联盟国家,已经将蔗糖转化酶活性作为评价蜂蜜是否新鲜的指标,在蜂蜜的贮藏过程中,蔗糖转化酶活性会随着贮藏时间的增加而降低,可以反映出蜂蜜的贮藏时间。

3加工对蜂蜜的酶活影响

在蜂蜜的加工过程中,热处理是不可缺少的环节。尤其是热带地区的蜂蜜,即使封盖,其水含量也比较高,容易发酵,需要加热脱水。此外,大多数蜂蜜都会结晶,蜂蜜的解晶液化,罐装降低粘度等都需要加热处理。目前,存在对蜂蜜过度热处理的情况,过度的加热处理会加剧美拉德反应和氧化反应,产生有害物质(如HMF等),并使蜂蜜的活性物质损失,最终降低蜂蜜的品质。

表2 国内外现行标准中蜂蜜淀粉酶值的设定

 

注:—表示未做要求。

 

 

3.1淀粉酶活性在蜂蜜加工过程中的变化

 

蜂蜜中淀粉酶活性随着加工温度的升高而降低。王琴等研究表明在蜂蜜加工过程中,时间和温度均是影响其淀粉酶活性的显著因素,其中温度对淀粉酶活性的影响更为明显,并指出从淀粉酶活性角度考虑,蜂蜜的加工温度不能高于70℃,加热时间小于30 min。

 

 

国占宝等研究表明在蜂蜜的加工过程中,当加热时间在2 h范围内,温度是淀粉酶值变化的主要因素,时间对淀粉酶值没有显著影响;而当温度低于60℃,时间小于2 h,淀粉酶活性基本不变。而COZMUTA等研究表明淀粉酶活性对加热时间比温度更敏感。

 

 

TOSI等研究了等温加热(温度60～100℃,时间2～20 min)和瞬时加热(温度60～100℃,时间14 s)对蜂蜜淀粉酶活性的影响,发现随着温度的升高,这2种加热方式处理的蜂蜜其淀粉酶活性均出现下降,还发现在等温加热阶段,随着加热时间的延长,有些样品出现淀粉酶值随着加热时间的延长而增大的情况,而且差异具有生物统计学意义(P<0.05)。另外,有的蜂蜜样品在90℃条件下加热20 min仍然可以满足现行标准中的规定(DN≥8,HMF≤60 mg/kg)。所以仅仅依靠淀粉酶活性的变化不能作为检测蜂蜜是否经过热处理加工的手段。

 

 

HUANG等利用可见光/近红外光谱分析了110个蜂蜜样品中淀粉酶活性随加热时间(2～12 h)和加热温度(40～80℃)的变化,结果表明随着温度的升高和加热时间的延长,蜂蜜淀粉酶活性降低,而且不同植物源蜂蜜的淀粉酶对温度的耐受性存在差异,他们认为蜂蜜加工的最佳温度为60℃。

 

 

总之,蜂蜜中淀粉酶活性会受到加工温度和时间的影响,蜂蜜的加工温度不能高于70℃,时间不超过30 min。至于淀粉酶活性对于加工温度和时间哪个更敏感,不同的研究者有不同的看法,这可能是与蜂蜜的品种有关。

 

 

由于传统热加工方式会对蜂蜜品质造成负面影响,就有不少学者开始寻找替代方案。高静压(HHP)是一种非热加工处理方式,在常温或较低温度下,以100 Mpa以上压力处理食品达到杀菌作用,此方法可以保留食品中的大部分生物活性物质,对其感官特性影响较小。

 

 

目前,HHP对蜂蜜中淀粉酶活性的影响尚存异议。RAZALI等比较了室温下HHP处理(200、600 Mpa)对蜂蜜淀粉酶活性的影响,发现高压处理对蜂蜜淀粉酶活性没有显著影响,高压处理对蜂蜜酶活及品质方面的影响优于传统热加工。但罗子阳等采用HHP不同压力(300、450、600 MPa)和时间(5、10、20 min)处理蜂蜜,结果显示压力和时间对蜂蜜淀粉酶和蔗糖转化酶活性都具有明显影响。

 

 

3.2蔗糖转化酶活性在蜂蜜加工过程中的变化

 

不同的加工方式对蜂蜜中酶活性的影响不一样。BONVEHÍ等研究了不同加工工艺对蜂蜜中蔗糖转化酶活性的影响,将蜂蜜分别在45℃加热24 h,电热棒(1 k W)加热15 h,78℃加热20 s,真空(300mm Hg) 60℃加热30 min,结果显示,蜂蜜中蔗糖转化酶活性分别平均降低了17%、80%、93%和55%。

 

 

陶琼的研究表明当加工温度超过50℃时,蔗糖转化酶活性的降低比淀粉酶迅速,蔗糖转化酶不仅在蜂蜜成熟过程中起着重要作用,还在之后的贮存过程中继续将蔗糖转化为单糖,所以加工中应该保护蔗糖转化酶活性,蜂蜜加工工艺中熔蜜过滤等温度设定应低于45℃。

 

 

微波加热具有加热均匀、速度快等优点,有研究表明微波加热对蜂蜜中HMF的形成和酶活没有显著影响,但也有研究认为微波加热会造成HMF的快速形成,但不会使淀粉酶值低于国家标准。STANISLAW等研究了微波加热(1.26 W/g,3 min)对蜂蜜淀粉酶和蔗糖转化酶活性的影响,结果发现微波加热显著降低了蜂蜜中的淀粉酶和蔗糖转化酶活性。

 

 

4酶在蜂蜜掺假检测中的应用

 

蜂蜜成分复杂,市场上的蜂蜜造假手段层出不穷且愈发高端,传统的检测方法已经无法满足蜂蜜鉴别的需要,所以亟需一些其他手段辅助检测蜂蜜掺假。由于糖浆清亮透明、黏稠度较高,而且其主要成分与蜂蜜的主要成分相同,都是果糖和葡萄糖,所以一些不良商家为了牟取利益,就在蜂蜜中掺入各类糖浆。目前,糖浆行业多用α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶和β-呋喃果糖苷酶等工业酶进行糖浆的生产,这些酶大多来源于细菌或真菌,耐高温,可以通过高温下酶活变化或者检测外源性酶来鉴别掺假蜂蜜。

 

 

4.1淀粉酶在蜂蜜掺假检测中的应用

 

蜂蜜中含有α-淀粉酶和β-淀粉酶,研究发现蜂蜜中的淀粉酶对温度比较敏感,随着温度的升高其活性下降明显。糖浆生产中的淀粉液化是在工业α-淀粉酶的作用下淀粉聚合物颗粒的高浓度悬浮液转化为一种低粘度的可溶性短链糊精溶液的过程,此过程是生产淀粉类糖浆(包括大米糖浆、木薯糖浆、小麦糖浆和玉米糖浆等)的关键环节,而且加热温度大约在72℃以上,常规α-淀粉酶在此条件下失活,所以需要添加耐高温的α-淀粉酶。

 

 

在选择性灭活条件下(70℃加热30 min),对于不含耐高温淀粉酶的蜂蜜其淀粉酶活性完全丧失,而对于掺有外源性淀粉类糖浆的蜂蜜,仍然保有淀粉酶活性,从而可以鉴别蜂蜜是否掺入淀粉类糖浆。

 

 

李军生等和鲍会梅研究表明,新鲜天然蜂蜜的淀粉酶活性受温度和贮存时间影响较大,而掺假蜂蜜几乎不受影响。李军生等和叶云等研究了天然蜂蜜(龙眼蜜和菊桉蜜)淀粉酶同工酶谱带与工业α-淀粉酶同工酶谱带,结果发现二者明显不同,可以通过淀粉酶同工酶谱带差异鉴别掺假蜂蜜。

 

 

γ-淀粉酶能水解淀粉中的α-1,4葡萄糖苷键,它与α-淀粉酶联合作用能较快地将淀粉转化成淀粉类糖浆,所以在淀粉液化后需要添加γ-淀粉酶以进行下一步酶解。蜂蜜中不含有γ-淀粉酶,可以通过外源性γ-淀粉酶来鉴别掺入淀粉类糖浆的蜂蜜。费晓庆等先后建立了用液相色谱-同位素质谱联用法(LC-IRMS)及高效液相色谱-二极管阵列检测器联用法(HPLC-DAD)检测蜂蜜中外源性γ-淀粉酶残留量的方法,这两种方法对于从酶学的角度鉴别蜂蜜中淀粉类糖浆的掺入是有效的。此外,还可以通过液相色谱-串联质谱法(,LC-MS/MS)蛋白质组学的方法鉴定蜂蜜中是否掺入外源性淀粉酶。

 

 

4.2蔗糖酶在蜂蜜掺假检测中的应用

 

β-呋喃果糖苷酶是蔗糖转化酶的一种,特异性地催化非还原糖中的β-D-呋喃果糖苷键水解,不但可将蔗糖水解为葡萄糖和果糖,而且也能催化棉子糖生成蜜二糖和果糖。β-呋喃果糖苷酶可以催化水解甜菜糖浆的β-D-果糖苷键,并将其转化为一分子葡萄糖和一分子果糖,而β-呋喃果糖苷酶非蜂蜜本身所具有,所以可以通过检测外源性β-呋喃果糖苷酶来鉴定蜂蜜是否掺入甜菜糖浆。

 

 

王艳等通过示差折光-液相色谱法测定β-呋喃果糖苷酶酶解产物蜜二糖的含量从而确定蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶的残留量,并指出当蜂蜜样品中β-呋喃果糖苷酶活性超过20 U/kg时,即可判断为掺假蜂蜜,他们共检测了3924个蜂蜜样品,阳性检出率为15.8%。

 

 

免疫学方法具有操作方便、检测快速、高专一性等优点,有研究通过杂交瘤技术制备了抗β-呋喃果糖苷酶的单克隆抗体并将其成功运用于蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶的残留检测,为检测掺假蜂蜜中残留的β-呋喃果糖苷酶提供了新的技术手段。

 

 

还有研究发现蜂蜜中的淀粉酶和蔗糖转化酶活性之间存在较高的相关性,即蔗糖转化酶活性高的蜂蜜样品,其淀粉酶活性也较高,反之亦如此。SERRANO等检测了西班牙南部地区49个蜂蜜样品的淀粉酶和蔗糖转化酶活性,结果发现两种酶之间存在相关性(r=0.853),并指出在某种程度上,利用淀粉酶与蔗糖转化酶的相关性可以排除一些常见的掺假蜂蜜。

 

 

4.3β-葡萄糖苷酶在蜂蜜掺假检测中的应用

 

张金连等研究发现天然蜂蜜中均能检测到β-葡萄糖苷酶活力,而在大米高果糖浆中未检测到该酶活力,且发现随着蜂蜜中掺入大米高果糖浆比例增大,β-葡萄糖苷酶活力显著下降。所以可以从β-葡萄糖苷酶角度区分天然蜂蜜与大米高果糖浆,但无法鉴定天然蜂蜜中是否掺有大米高果糖浆。

 

 

5结束语

 

由于β-葡萄糖苷酶对温度不够敏感,而葡萄糖氧化酶对光和热较敏感(在60℃失活),且对过氧化氢酶有很强的依赖性,所以β-葡萄糖苷酶和葡萄糖氧化酶不适合作为蜂蜜质量控制的指标。

 

 

目前我国蜂蜜国家标准中只对淀粉酶活性进行了要求,但淀粉酶不是一个可靠的评价蜂蜜是否过度加热的指标,建议将蔗糖转化酶加入到蜂蜜国家标准中。此外,应进一步加强蜂蜜中的酶活研究,探明蜂蜜酶促反应过程中相关物质的变化规律及机制,为酶活指标在蜂蜜质量控制中的进一步应用和蜂蜜品质评价体系的完善提供科学根据和技术手段。

 

 

（来源：食品安全质量检测学报. 2021,12(21)北大核心， 蜂蜜中的酶及其在蜂蜜质量控制中的应用，张国志，张言政，李珊珊，胡福良，浙江大学动物科学学院）